Laboratorio di Genomica ed Epigenomica

Il Laboratorio di Genomica ed Epigenomica di AREA Science Park è una facility dedicata alle analisi di sequenze su DNA e RNA e genotipizzazione (microarrays). I servizi ed il personale di laboratorio hanno conseguito a partire dal 2018, la certificazione Propel-Certified Service Provider Illumina.

Servizi di sequenziamento e/o analisi dati

  • Sequenziamento e analisi di genomi e trascrittomi umani, animali, e microbici (DNA-seq e RNA-seq)
  • Sequenziamento e analisi di esomi umani
  • Sequenziamento di Analisi di Pannelli Genetici
  • Sequenziamento e analisi di microbioma attraverso sequenziamento di marcatori tassonomici (16S/ITS), metagenomica, e sequenziamento di ampliconi
  • Sequenziamento di metagenomica in matrici di vario tipo (derrate alimentari, suolo, ecc.) attraverso sequenziamento di marcatori tassonomici (16S/ITS) e sequenziamento di ampliconi
  • Sequenziamento miRNA-seq e smallRNA-seq per l’analisi di regolazione genica post- trascrizionale, CHIP-seq per l’analisi di interazione tra DNA e proteine istoniche
  • Genotipizzazione mediante Microarrays

Strumentazione di sequenziamento

NovaSeq 6000. Sistema flessibile ultramassivo di produzione di dati di sequenza del DNA, in grado di sequenziare in una sola corsa fino a 48 genomi umani a una profondità di 30×. Lo strumento mette a disposizione più formati di cella a flusso, diverse configurazioni di lunghezza di lettura e la possibilità di analizzare una o due celle a flusso contemporaneamente per ottenere un output di dati che va da circa 160 Gb a 6 Tb e fino a 20 miliardi di reads per corsa, fornendo flessibilità su un’ampia gamma di applicazioni e dimensioni di studi.

HiScanSQ. Lo strumento è costituito da due componenti, il lettore HiScan e il Modulo SQ. Il lettore HiScan esegue le analisi basate su microarray e il sequenziamento. Il modulo SQ è un dispositivo per la fluidica di manipolazione dei reagenti necessari per l’esecuzione del sequenziamento. HiScanSQ è attualmente la strumentazione di riferimento per BeadChip, ma rappresenta una soluzione di ripiego per il sequenziamento, con un elevato costo per gigabase prodotta. Lo strumento permette di ottenere dati analizzati da campioni di DNA in 8.5 giorni producendo fino a 150 gigabasi di dati in un’unica corsa, 750 milioni di letture con una lunghezza di 2×100 bp ciascuna e parametri di qualità eccezionali (> Q30). Secondo le stime illumina questi valori corrispondono a 1 Genoma umano per corsa oppure Esomi umani per corsa.

MiSeqDX. Piattaforma di sequenziamento massivo parallelo da utilizzare sia in modalità certificata IVD (In Vitro Diagnostic) che in modalità RUO (Research Use Only). Il sistema MiSeqDX Illumina unisce la tecnologia di sequenziamento mediante sintesi (SBS) Illumina con un flusso di lavoro che consente ai ricercatori di ottenere dati analizzati da campioni di DNA in appena otto ore (8h) producendo fino a 15 gigabasi di dati in un’unica corsa, 25 milioni di letture (“reads”) con una lunghezza di 2×300 bp ciascuna e parametri di qualità eccezionali (>Q30). MiSeq integra le funzioni di generazione di cluster, sequenziamento e analisi dei dati su un singolo strumento con una automazione totale e flessibilità nel processare pochi  campioni.

PromethION 24PromethION24 offre una tecnologia di sequenziamento del DNA e dell’RNA in tempo reale, diretta, capace di letture lunghe di singole molecole. Il sistema PromethION 24 offre la possibilità di far funzionare 24 celle di flusso, permettendo un sequenziamento on-demand, utilizzando qualsiasi cella di flusso in qualsiasi momento. È possibile avviare e interrompere l’esecuzione di singoli esperimenti a seconda delle necessità, o implementare più celle di flusso su singoli esperimenti per una maggiore velocità o produttività. Ogni cella a flusso consente di sequenziare fino a 3.000 nanopori simultaneamente, con un rendimento >4,8 Tb.


Attrezzature di laboratorio

Il Laboratorio è dislocato su una superficie di 220 MQ, con 20 postazioni di lavoro su bancone, 1 postazioni di lavoro su cappa chimica, 1 postazioni di lavoro su cappe a flusso laminare orizzontale, e sono allestiti con le seguenti dotazioni accessorie, per la preparazione e la manipolazione dei campioni nella fase di lavorazione preliminari e propedeutiche al sequenziamento:

  • Apparato semi-automatizzato TECAN EVO per il processamento parallelo di 384 campioni per protocollo Infinium (Tecan)
  • Illumina Hybridization Oven (Illumina
  • Bioanalyzer (Agilent Technologies)
  • qPCR STEP One PLUS (Applied Biosystem)
  • NanoDrop (ThermoFisher Scientific)
  • cBot Cluster Generation System (Illumina)
  • Covaris M220 sonicatore (Covaris)
  • I nuovi robot?

Protocolli

I protocolli di laboratorio per la manipolazione di campioni di DNA e RNA, per i controlli di qualità, e per la preparazione delle librerie sono non-proprietari e basati sui manuali d’uso dei kit commerciali di reagenti e della strumentazione dei fornitori Promega, QIAGEN, Illumina, NuGEN, Roche, Agilent Technologies, e/o su protocolli pubblicati in articoli scientifici, per i servizi sopra descritti. I protocolli di analisi dati sono basati su software open source oppure in licenza Illumina per le fasi comuni a tutte le applicazioni di: i) conversione dei dati Illumina da formato binario a sequenza grezza in formato testuale fastq, ii) demultiplexing dei campioni (bcl2fastq); iii) mascheramento degli adattatori e controllo di qualità (fastqc, cutadapt); iv) rimozione di porzioni di sequenza di bassa qualità e di sequenze contaminanti (ERNEfilter, bbduck).


Software e pipeline computazionali   

Il Laboratorio dispone di pipeline di analisi dati sviluppate al proprio interno per le seguenti applicazioni, che incorporano software open source e programmi proprietari:

  • Analisi di genomi, esomi e trascrittomi umani, animali, e microbici (DNA-seq e RNA-seq), per analisi di espressione genica differenziale (HTSeq-count, DEseq), per identificazione di varianti a singolo nucleotide (GATK), variazione nel numero di copie e altre varianti strutturali (DNAcopy, script proprietari)
  • Conversione tra formati di dati (Picard tools, Samtools, script proprietari)
  • Analisi di Pannelli Genetici (BWAmem, GATK, Annovar)
  • Analisi di metagenomica su microbioma umano e su campioni di piante, animali, e microorganismi e matrici di vario tipo (derrate alimentari, suolo, ecc.) basate su QIIME2
  • Genotipizzazione mediante Microarrays (script proprietari)
  • Analisi delle varianti di singolo nucleotide in regioni target (GATK)

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